Cпектрофотометрия: принцип метода, устройство прибора и применение в количественном анализе

Спектрофотометрия – это физико-химический метод определения состава и концентрации веществ путем регистрации поглощения света в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной частях спектра. Способ необходим, чтобы определить плотность растворенных соединений, идентифицировать химические вещества и изучать их молекулярный состав. Оптическая спектрофотометрия базируется на избирательном поглощении молекулами излучения с конкретной длиной волны. Уникальность спектра поглощения для каждого вещества обеспечивает методу широкое применение в качественном и количественном анализе в химических, биологических, медицинских и экологических лабораториях. Способ применим к образцам как в жидкой, так и в твердой форме.

Измерения по методу спектрофотометрии ведутся в трех спектральных зонах. Ультрафиолетовая область от 200 до 400 нанометров. Видимый глазом свет от 400 до 760 нанометров. Инфракрасное излучение от 760 нанометров вплоть до нескольких сотен микрометров. Спектрофотометрию в УФ области задействуют при работе с нуклеиновыми кислотами и белковыми молекулами. Спектрофотометрию в видимой области выбирают для анализа окрашенных проб и количественного определения металлов после перевода их в комплексные формы. 

Основы спектрофотометрии

В классификации аналитических методов спектрофотометрию относят к абсорбционным, поскольку она измеряет долю поглощенного излучения. Молекулярная абсорбционная спектрофотометрия исследует ослабление светового потока при прохождении через раствор, вызванное поглощением энергии молекулами растворенного соединения. При попадании луча в кювету часть света задерживается образцом, остальное выходит с противоположной стороны, небольшой процент отражается от стекла. Величину, показывающую, какая часть светового потока беспрепятственно миновала образец, принято обозначать термином «пропускание».

Оптическая плотность в спектрофотометрии равна десятичному логарифму частного от деления исходной силы света I₀ на силу света I, дошедшего до детектора. Именно эту величину измеряет спектрофотометр и выводит на дисплей или передает в программное обеспечение. При неизменной длине волны и фиксированной толщине кюветы оптическая плотность растет прямо пропорционально увеличению содержания вещества в растворе.

Ключевым понятием в основах спектрофотометрии является длина волны. Единица измерения – нанометр (нм). Она выбирается исходя из вида исследуемого соединения и его спектральных свойств. При количественном определении рабочую длину волны выбирают в точке максимума поглощения анализируемого соединения. Такой подход гарантирует предельную чувствительность метода и сводит к минимуму ошибку измерения.

Спектр поглощения – это кривая, отображающая изменение оптической плотности образца в зависимости от длины волны либо частоты падающего излучения. На нем видны характерные пики и минимум, которые формируют уникальный рисунок для каждого соединения. 

Местоположение пиков на оси длин волн служит маркером химической природы соединения, тогда как интенсивность этих пиков дает информацию о его содержании в пробе. В арсенале методов анализа в спектрофотометрии присутствуют градуировочные зависимости, прием добавок и дифференциальная схема, позволяющая раздвинуть границы определяемых концентраций.

На чем основан метод спектрофотометрии?

Спектрофотометрические методы объединяют приемы идентификации веществ и определения их содержания, базирующиеся на избирательном поглощении молекулами монохроматического света. Измерения ведутся в трех спектральных зонах: ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной.

Фундамент метода с точки зрения физики описывает закон Бугера-Ламберта-Бера. Согласно закону, оптическая плотность линейно зависит от двух величин: концентрации вещества и длины кюветы. Формула: A = ε·c·l, в которой: 

• A – оптическая плотность;
• ε – молярный коэффициент поглощения; 
• c – концентрация в молях на литр;
• l – путь луча в сантиметрах.

Величина молярного коэффициента поглощения отражает, насколько активно конкретное химическое соединение задерживает световой поток заданной длины волны. Для одного и того же вещества этот параметр остается неизменным, если зафиксированы длина волны и условия проведения замера. Прямая связь очевидна: большее значение коэффициента обеспечивает более высокую отзывчивость метода на присутствие аналита. В повседневной лабораторной работе нередко оперируют удельным показателем. Под ним понимают оптическую плотность жидкой пробы с содержанием растворенного компонента 10 граммов на литр, помещенной в кювету толщиной 1см.

Суть спектрофотометрии в регистрации того, насколько ослабевает световой поток, проходя сквозь анализируемый образец. Молекулы присутствующего в растворе соединения захватывают фотоны, вследствие чего переходят в электронно-возбужденное состояние. При этом энергия поглощаемого кванта обязана строго совпадать с энергетической разницей между основным и возбужденным уровнями данной молекулы. Именно это условие обусловливает то, что каждое вещество реагирует только на излучение с вполне конкретными длинами волн, формируя тем самым свой неповторимый спектр.

Спектрофотометрия основана на выборочном характере отклика молекул на электромагнитные волны. В диапазонах ультрафиолетового и видимого излучения поглощение определяется электронными переходами внутри молекул. В инфракрасном диапазоне картинка иная: здесь доминирующую роль играют колебательные и вращательные движения атомов относительно друг друга. Применительно к воде и водным системам спектрофотометрический анализ, как правило, проводится в УФ- и видимом диапазонах: вода практически прозрачна в этой спектральной области и не вносит помех в результаты измерений.

Пропускание в спектрофотометрии показывает, какая часть света прошла сквозь кювету. Его записывают как T = I/I₀ и переводят в проценты. Формула A = -lg T связывает его с оптической плотностью. Нулевая плотность соответствует стопроцентному пропусканию. При T = 10% плотность A = 1,0. Приборы рассчитаны на измерения в коридоре A от 0,1 до 1,0, при таких значениях ошибка минимальна.

Чем спектрофотометрия отличается от флуориметрии?

Разница между спектрофотометрией и флуориметрией заключается в типе регистрируемого сигнала. В первом случае измеряют ослабление света, во втором возникновение нового света.

Флуоресценция – свойство конкретных молекул излучать поглощенную ранее энергию. Это избирательное явление, которое иногда создает помехи при спектрофотометрических замерах в виде фонового свечения. Флуориметрический анализ целенаправленно использует этот эффект для обнаружения и количественной оценки флуорофоров.

Спектрофотометрия измеряет поглощение. Эта характеристика присуща практически любому веществу в растворе, поэтому метод служит универсальным инструментом лабораторной практики. Где флуориметрия требует наличия специфической метки или природного свечения, спектрофотометрия работает напрямую с веществом.

Как устроен прибор спектрофотометр?

Спектрофотометры выпускаются в разных конструкциях.

• В инфракрасных моделях часто используют метод пропускания излучения через образец. Схема работы простая: источник направляет ИК-луч через пробу на детектор, а прибор определяет, сколько энергии поглотилось.
• В основе фурье-спектрометров лежит интерферометр Майкельсона, который разделяет луч на два, а затем сводит их, создавая интерференционную картину. Одно из зеркал движется, меняя разность хода лучей. Детектор фиксирует интерферограмму, а с помощью Фурье-преобразования ее превращают в обычный ИК-спектр.
• УФ- и видимые спектрофотометры устроены иначе, чем ИК-приборы, и бывают двух типов по расположению монохроматора. При измерении прибор сравнивает отраженный луч от пробы с лучом от эталона с нулевым поглощением, вычисляет их логарифмическое отношение – оптическую плотность. По ней через закон Бугера–Ламберта-Бера находят концентрацию, а по положению максимума поглощения определяют качественный состав.

Спектрофотометр состоит из нескольких основных узлов, каждый из которых отвечает за свой этап измерения:

1. Источник света.
2. Монохроматор.
3. Отсек для кювет.
4. Детектор.
5. Система обработки данных.

Оптическая схема собрана так, чтобы обеспечить высокую точность и воспроизводимость результатов, а также свести к минимуму влияние фонового и рассеянного света.

Чувствительность приборов высока, но зависит от режима работы и настроек под конкретную задачу. Работоспособность определяется тремя параметрами: шириной спектральной полосы, аппаратной погрешностью и разрешающей способностью. Первые два регулируются через монохроматор и источник, а аппаратная погрешность заложена в конструкции прибора.

Плюсы и минусы использования спектрофотометра

Выбор аналитического оборудования требует понимания сильных и слабых сторон метода. Спектрофотометрия занимает устойчивую позицию в лабораторной практике благодаря сочетанию доступности и надежности, однако имеет определенные ограничения.

Преимущества спектрофотометрического анализа:

• Высокая чувствительность. Позволяет определять вещества в микроколичествах. Для анализа достаточно нескольких миллилитров или даже микролитров раствора.
• Быстрое получение результата. Одиночное измерение занимает несколько секунд. Подготовка образца сводится к растворению пробы и при необходимости добавлению реагентов для получения окрашенного соединения. За рабочий день можно проанализировать сотни образцов.
• Широкая доступность оборудования. Спектрофотометры выпускаются множеством производителей в различных ценовых категориях – от портативных устройств до исследовательских систем высокого разрешения.
• Неразрушающий характер анализа. После измерения раствор можно использовать для других исследований. Это критично при работе с дорогими или уникальными образцами.
• Высокая воспроизводимость результатов. При соблюдении методики относительное стандартное отклонение не превышает 1-2%.
• Автоматизация измерений. Современные приборы оснащены автоподатчиками образцов, термостатированием ячеек и программным обеспечением для обработки данных. Возможность автоматизации снижает влияние человеческого фактора.
• Универсальность. Метод измерения и анализа охватывает широкий круг веществ.

Недостатки:

• Необходимость растворения образца ограничивает применение для нерастворимых элементов. Твердые вещества требуют предварительной пробоподготовки. Не все соединения растворяются в доступных растворителях.
• Ограниченная селективность. Материалы со сходной структурой могут иметь перекрывающиеся спектры поглощения, что затрудняет их раздельное определение в смеси.
• Помехи со стороны матрицы. Посторонние составляющие образца, не подлежащие определению, способны перехватывать излучение на аналитической длине волны либо вступать в химическую реакцию с целевым компонентом.
• Необходимость калибровки. Количественное определение невозможно без предварительного построения калибровочного графика по серии эталонных растворов с известным содержанием аналита.
• Ограниченный диапазон определяемых концентраций. Когда оптическая плотность превышает значение 2,0, ошибка замера стремительно растет, поскольку до детектора доходит слишком слабый световой поток.
• Требования к чистоте кювет. Загрязнения на поверхностях, отпечатки пальцев, пузырьки воздуха в образце искажают результаты измерений.
• Температурная зависимость. Оптическая плотность многих растворов изменяется при колебаниях температуры, поэтому требуется контроль.

Правовое регулирование 

Применение метода фигурирует в десятках действующих госстандартов. Среди основных можно выделить три документа. ГОСТ Р 58399-2019 закрепляет общие рамки применения оптической дефектоскопии. ГОСТ 8.557-2007 вводит государственную поверочную схему для аппаратуры, регистрирующей коэффициенты светопропускания и величину поглощения. ГОСТ Р 8.657-2009 содержит конкретную методику, по которой выполняется проверка инфракрасных спектрометров.

Где и для чего применяется спектрофотометрия?

Спектрофотометрия нашла применение практически во всех областях, где требуется количественный или качественный анализ веществ. Метод востребован в научных исследованиях, промышленном контроле качества, клинической диагностике и экологическом мониторинге.

1. Фармацевтика. В производстве лекарств спектрофотометр используют на трех этапах. Сначала убеждаются, что в таблетке или растворе именно то действующее вещество, которое заявлено. Затем определяют его точное количество. И наконец, проверяют, нет ли в субстанции посторонних примесей – их выдают лишние пики поглощения. А чтобы прибор не врал, его регулярно проверяют по стандартному раствору дихромата калия, как того требует фармакопея.

   Анализ чистоты субстанции нацелен на обнаружение посторонних включений и продуктов распада. Подлинность соединения устанавливают путем сопоставления зарегистрированного спектра с эталонным спектром. Любые расхождения в очертаниях полос или сдвиги их максимумов по шкале длин волн сигнализируют о подделке.

   Изучение стабильности препаратов проводится при разработке новых лекарств. Образцы хранят при разных условиях и периодически анализируют. Изменение спектра сигнализирует о деградации действующего вещества.

   Растворение таблеток и капсул тестируется на специальных установках. Спектрофотометр измеряет концентрацию высвобождающегося вещества в определенные моменты времени. Профиль растворения характеризует качество лекарственной формы.

2. Клиническая лабораторная диагностика. В основе работы биохимических анализаторов лежит принцип спектрофотометрии. Фотометрическими методами в сыворотке крови определяют содержание глюкозы, холестерина, триглицеридов, мочевины, креатинина, общего белка, билирубина, а также регистрируют каталитическую активность ферментов. Точность количественного анализа методом спектрофотометрии соответствует клиническим требованиям и служит надежной опорой для диагностики и отслеживания эффективности лечения.
3. Контроль качества воды. Метод спектрофотометрии включен в нормативные документы для определения множества показателей. Измеряют содержание нитратов, нитритов, аммония, фосфатов, железа, марганца, алюминия, хлоридов, сульфатов. Анализ выполняется после переведения определяемого компонента в окрашенное соединение с помощью специфических реагентов. УФ-видимая спектрофотометрия применяется также для оценки общего органического углерода и химического потребления кислорода. Регулярный мониторинг водоемов выявляет загрязнения на ранних стадиях.
4. Пищевая промышленность. Контролируется содержание консервантов, красителей, витаминов и токсичных элементов в продуктах питания. Спектрофотометрические методики используются для анализа вина, пива, соков, молочных продуктов, растительных масел. Определяются показатели окислительной порчи жиров, цветность сахара и растительных масел, содержание общего азота.
5. Научные исследования в биохимии и молекулярной биологии. Измерение концентрации нуклеиновых кислот и белков – рутинная  операция в каждой молекулярно-биологической лаборатории. По соотношению оптических плотностей оценивают чистоту препаратов ДНК и РНК. УФ-спектрофотометрия – стандарт для анализа ПЦР-продуктов.
6. Экологический мониторинг. В изучение почв и грунтов входит определение гумуса, подвижных форм элементов питания, тяжелых металлов. Спектрофотометрический метод дополняет другие способы исследования, давая информацию о химическом составе.
7. Металлургия и горнодобывающая промышленность. Анализ руд, концентратов и готовой продукции на содержание ценных и примесных элементов. Определяются железо, медь, никель, кобальт, хром, марганец, титан, ванадий и другие металлы после переведения в окрашенные комплексные соединения.
8. Полиграфическое производство. Монохроматический источник света в спектрофотометре позволяет с высокой точностью оценивать цветовые характеристики объектов. Благодаря этому приборы прочно вошли в практику полиграфии и работы с растровой графикой. С их помощью проводят локальные замеры плашек и автоматизированный анализ тестовых мишеней. Итогом измерений становится набор числовых параметров, используемый для калибровки печатного оборудования в строгом соответствии со спецификацией ICC. Такая настройка минимизирует искажения цвета при выводе изображения на печать.
9. Криминалистика и судебная экспертиза. Исследование состава неизвестных веществ, идентификация наркотических средств, анализ чернил и красителей при экспертизе документов. Сущность метода спектрофотометрии позволяет устанавливать подлинность или подделку по спектральным характеристикам материалов.
10. Безопасность. Спектрофотометры – это высокочувствительное оборудование, способное выявлять мельчайшие примеси разных веществ.  Системы авиационной безопасности используют спектрофотометрию для выявления опасных материалов. Специальные анализаторы обнаруживают настолько малые количества взрывчатых соединений, что достаточно буквально нескольких молекул, перенесенных с рук на застежку сумки.

Определение результатов спектрофотометрии

Спектрофотометрия – простой и надежный метод. Точность данных зависит от понимания его физических основ, правильной работы с прибором и верной интерпретации результатов.

Современные спектрофотометры автоматически корректируют помехи, возникающие при измерениях. Например, эффект сита, который появляется при высокой концентрации раствора, когда частицы вещества заслоняют друг друга от света. Новые модели приборов выявляют эффект по косвенным признакам. При обнаружении признаков экранирования оборудование предупреждает оператора о возможном росте погрешности измерений.

Регистрируемую величину, в данном случае, оптическую плотность делят на два типа. Обычная плотность – это показания, снятые с детектора без обработки. Относительная плотность – это сравнение сигнала с эталоном или базовой линией. Относительная оптическая плотность вычисляется как отношение поглощения пробы к поглощению холостого раствора. Холостые растворы применяют, когда оптические свойства вещества заметно отклоняются от закона Бугера-Ламберта-Бера, и когда используют устаревшие спектрофотометры без функций автокоррекции.

Для надежности делают минимум три замера на образец и вычисляют среднее. Это снижает случайные погрешности и влияние помех вроде эффекта сита или агрегации частиц.

Стандартные образцы для контроля точности ИК-спектрометрии на примере анализа бензина

Количественный анализ методом спектрофотометрии дает надежный результат только тогда, когда прибор откалиброван и его показания регулярно проверяются. Для этого используют стандартные образцы (СО) – материалы с точно установленным составом, относительно которых оценивают правильность измерений. Без них невозможно подтвердить, что результаты спектрофотометрического анализа соответствуют реальному составу пробы, а не погрешности самого прибора.

Б-ИК-ПА – стандартный образец состава и детонационной стойкости бензина, который применяется именно в ИК-спектрометрии. Предназначен для аттестации, валидации и верификации методик измерений, проверки оборудования и контроля точности результатов при определении оксигенатов, олефинов и ароматических углеводородов в бензине, а также его детонационной стойкости.

Образец аттестован по девяти показателям – от объемной и массовой доли метил-трет-бутилового эфира и этанола до содержания бензола, олефинов, ароматических углеводородов и октанового числа по моторному и исследовательскому методу. Это позволяет использовать его как для калибровки средств измерений, так и для контроля стабильности градуировочной характеристики уже настроенного прибора.

Б-ИК-ПА является аналогом ГСО 8143-2002 (С4) и востребован в нефтехимической, нефтеперерабатывающей и химической промышленности, то есть, везде, где ИК-спектрометрию применяют для оперативного контроля качества топлива. Образец поставляется во флаконах по 25 мл, комплект включает 5 флаконов с этикетками и паспорт.

Часто задаваемые вопросы

Можно ли анализировать мутные растворы?

Мутные растворы рассеивают свет, что дает ложное увеличение оптической плотности. Взвешенные частицы необходимо удалить фильтрованием или центрифугированием. Если частицы не отделяются (коллоидные растворы), можно измерять мутность как отдельный параметр на нефелометре. Некоторые методики предусматривают внесение поправки на рассеяние путем измерения на длине волны, где вещество не поглощает.

Насколько точен метод?

При соблюдении условий погрешность минимальна и подходит для лабораторных задач.

Зачем нужна холостая проба?

Холостая проба содержит все компоненты, кроме определяемого вещества. Измерение холостой пробы компенсирует поглощение растворителя, реактивов, кюветы. Без этой поправки результаты будут завышены. Холостую пробу готовят тем же способом, что и анализируемые образцы, проводя через все стадии пробоподготовки. Это позволяет учесть загрязнения, вносимые реактивами.

Можно ли использовать метод для воды?

Да, метод спектрофотометрия воды применяется для контроля загрязнений и содержания веществ.

Почему результаты не воспроизводятся?

Причин может быть несколько. Нестабильность растворов, если вещество разлагается, окисляется или гидролизуется, концентрация меняется между измерениями. Колебания температуры влияют на оптическую плотность некоторых растворов. Недостаточный прогрев лампы приводит к дрейфу базовой линии. Загрязнение кювет дает случайные ошибки. Необходимо проверить каждый фактор последовательно.

Что влияет на результат измерения?

Чистота кюветы, правильный выбор длины волны, стабильность излучения и точность приготовления раствора. 

Нужно ли калибровать прибор перед каждым измерением?

Базовую проверку проводят перед каждой серией измерений. Полную калибровку по длине волны и фотометрической точности выполняют реже, обычно раз в неделю или месяц в зависимости от интенсивности использования. Построение калибровочной кривой необходимо для каждой новой методики, после замены реактивов, при смене партии кювет. Стабильность калибровки проверяют контрольным образцом.

Как повысить точность анализа?

Для этого используются свежие растворы и проверяется прибор перед каждым измерением. Важно избегать загрязнения и работать при стабильной температуре.

В чем отличие спектрофотометра от фотоколориметра?

Спектрофотометр использует монохроматическое излучение, выделяемое дифракционной решеткой или призмой, и позволяет работать при любой длине волны в пределах рабочего диапазона. Фотоколориметр оснащен набором сменных светофильтров, пропускающих относительно широкие полосы излучения. Спектрофотометр обеспечивает более высокую точность, селективность и возможность записи спектров поглощения. Фотоколориметр проще конструктивно, дешевле и удобен для рутинных измерений при фиксированных длинах волн.

Возможно ли использовать загрязненные кюветы?

Категорически не допускается. Любое загрязнение оптических поверхностей кюветы вносит погрешность в измерения. Жирные следы от пальцев, остатки жидкости, пыль вызывает рассеяние светового потока и завышают регистрируемую оптическую плотность. После каждого замера ячейку моют дистиллятом и ополаскивают рабочим раствором. Кюветы держат в закрытом контейнере. При работе их удерживают исключительно за матовые боковины, не прикасаясь к прозрачным граням.

Источники информации:

1. 1. https://vistaros.ru/stati/analizatory/vozmozhnosti-spektrofotometricheskogo-titrovaniya.html
   2. https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-14/1/1-2/1-2-1/1-2-1-1/spektrofotometriya-v-ultrafioletovoy-i-vidimoy-oblastyakh/
   3. https://elib.gsu.by/bitstream/123456789/6983/5/Лекция%202М%2B%20Методы%20спектрофотометического%20анализа.pdf
   4. https://www.ecoview.ru/info/blog/spektrofotometriya_osnovy_i_primenenie/
   5. https://elar.urfu.ru/bitstream/10995/36055/1/978-5-7996-1478-2_2015.pdf
   6. https://millab.ru/press-tsentr/articles/spektrofotometry/
   7. https://ru.wikihow.com/провести-спектрофотометрический-анализ